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碘化丙啶; Propidium iodide;PI
简介：Propidium iodide是可用于细胞染色的红色荧光染料。本品为碘化丙啶(PI)的粉末产品，另有溶液产品
分子式：C27H34I2N4 分子量：668.39
外观：红色结晶粉末
熔点：225℃(dec.)
激发波长Ex (nm) 535
发射波长Em (nm) 617
溶解性：在水中的溶解度为1 mg/ml
纯度：≥95% (HPLC)
用途及描述：科研试剂，广泛应用于分子生物学，药理学等科研方面，严禁用于人体。核酸荧光染色剂。碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）是一种常用的细胞核荧光染料，作为一种溴化乙锭（EB）的类似物，能够嵌入碱基之间实现与DNA结合。这种结合没有或者几乎无序列倾向性，大约每4-5个DNA碱基对结合一个染料。PI也能与RNA结合，需要用核酸酶处理来区分DNA和RNA染色。水溶液中PI的最大激发/发射波长是493/636nm。一旦与核酸结合，荧光信号明显增强20-30倍，最大激发波长向红色波段迁移~30-40nm，最大发射波长向蓝色波段迁移~15nm，从而使其最大激发/发射波长变为535/617nm。PI的摩尔吸光系数相对比较低，但是其具有足够大的斯托克司频移来同时检测核酸DNA和荧光标记抗体，只需要使恰当的滤片。PI适用于荧光显微镜，共聚焦显微镜，流式细胞仪以及荧光计分析。PI不能穿透细胞膜而被排斥在活细胞外，但是可以穿过破损的细胞膜而对核染色。利用这一特性，通常与Calcein-AM、Hoechst 33258或 Hoechst 33342等活细胞荧光探针一起使用，同时对活细胞和死细胞染色和鉴定，用于细胞凋亡相关的研究。也可以用作多重荧光染色的复染剂，兼容于各种细胞标记技术，包括直接或者间接的荧光抗体检测，mRNA原位杂交，细胞结构特异性的荧光探针检测法以及组织染色。PI的单独染色也可以进行细胞周期的检测。
使用方法推荐：
1.储存液的配制：称取1mg PI粉末（M. Wt= 668.4），用1ml去离子水充分溶解后配置成1mg/ml（1.5 mM）的储存液。4 ºC避光保存，至少6个月稳定。
2.贴壁细胞复染步骤（荧光显微镜检测）
样本准备：根据自身样本选择合适的步骤固定细胞。PI染色一般在其它染色完成后再进行。PI复染要求细胞经透化处理。
RNase酶处理：若样本使用多聚甲醛，甲醛或者戊二醛固定，则需要进行RNase处理。若样本用甲醇/醋酸或者丙酮固定，通常不需要此步操作。a，于2×SSC (0.3 M NaCl, 0.03 M sodium citrate, pH 7.0)溶液平衡样本；b，将本品置于含有100 µg/mL DNase-free RNase的2×SSC溶液中37°C孵育20min；c，用2×SSC溶液清洗样本3次，每次1min。
复染：a，于2×SSC (0.3 M NaCl, 0.03 M sodium citrate, pH 7.0)溶液平衡样本；b，直接用2X SSC稀释1mg/ml（1.5 mM）PI储存液 1:3000，得到500 nM的PI工作液。通常添加300µL染液足够用于一个盖玻片细胞制片。染色1-5min。c，2×SSC清洗几次，流尽多余的缓冲液后，加入抗淬灭剂封片。d，选择荧光显微镜的合适滤片进行观察。
3.悬浮细胞复染步骤（流式细胞仪检测）
样本准备：根据自身样本选择合适的步骤固定细胞。或者使用如下的步骤：a， 收集一定量的细胞，密度约 2 × 105 ~1 × 106。离心收集细胞，吸掉上清液，用手轻弹管壁就剩下的液体重悬细胞。之后加入1ml常温存放的PBS；b， 将所有的重悬细胞转移到4ml于-20ºC预冷的无水乙醇，在高速涡旋混匀的同时一边用枪缓慢的添加细胞悬液到乙醇内。于-20ºC乙醇中固定5-15min。离心收集细胞，除去乙醇。用手轻弹管壁以弹松细胞后，加入5ml室温的PBS。允许细胞水化15min；
复染a，用稀释液（100 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2 , 0.5 mM MgCl2 , 0.1% Nonidet® P-40）稀释1mg/ml（1.5 mM）PI储存液 1:500，得到3 µM的PI工作液。1ml的PI染色液足够用于每个细胞样本的检测。注：工作液的使用浓度可以根据自身实验体系调整，也可以直接使用PBS，HBSS等缓冲液直接稀释PI储存液到需要的浓度。b， 样本制备的最后一步后离心收集细胞，去除上清，用手轻弹管壁以弹松细胞后，加入1ml的PI染色工作液。室温孵育15min后，流式细胞仪进行细胞分析。若用流式显微镜观察，则需要离心样本，去除上清并重悬细胞在新鲜的缓冲液中。吸取1滴悬液到载玻片上，盖上盖玻片后观察。
4.染色质FISH复染步骤
样本准备：根据标准步骤制备样本。复染之前的最后一步用去离子水清洗样本以去除玻片上残留的缓冲盐。室温晾干。此步骤有助于减少非特异性的背景染色。
复染a，工作液的配制：用PBS缓冲液直接稀释1 mg/ml（1.5 mM）的PI储存液1:1000，得到1.5 µM的PI染色工作液。滴加300µL的工作液直接到样本。有必要的话，工作液内加入新鲜制备的RNase A（终浓度：10 µg/mL）。可使用塑料盖玻片均匀分布染液在载玻片上。室温避光条件下孵育样本30 min；如果加入RNase则37ºC孵育。b. 去除盖玻片，用PBS或去离子水清洗以除去没有结合的染料；c.用吸水纸巾围绕着样本周围吸取残留液体，盖上
